Pažangiosios biotechnologijos ir eksperimentinės terapijos leidinys J Adv Biotechnol Exp Ther. 2021 rugsėjis; 4 (3): 290-297

Antivirusinis medaus ekstrakto Camelyn poveikis SARS- CoV-2
Lilija Kaledienė , Mariana Baz2, Aura Liubavičiūtė 3’4, Genė Biziulevičienė4, Ingrida Grabauskytė5 Rūta Bieliauskienė6, Paulius Jovaišas6, Nidas Jurjonas7 *
I Vilniaus universiteto Gyvybės mokslų centro Mikrobiologijos ir biotechnologijos katedra, Lietuva.
2 Infekcinių ligų tyrimų centras, Kvebeko-Lavalo universiteto CHU, Kvebeko miestas, QC, Kanada.
3 Farmacijos centras, Vilniaus universiteto Medicinos fakulteto Biomedicinos mokslų institutas, Lietuva.
4 Valstybinio tyrimų instituto Inovatyvios medicinos centro biomodelių skyrius, Vilnius, Lietuva.
5 Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Fizikos, matematikos ir biofizikos katedra, Kaunas.
6 UAB „Silicio Biotechnologijos”, Vilnius, Lietuva.
7 7 UAB „Guruma”, Kaunas, Lietuva.
SANTRAUKA
Šio tyrimo tikslas – įvertinti galimą antivirusinį medaus ekstrakto Camelyn poveikį sunkaus ūminio respiracinio sindromo koronaviruso 2 (SARS-CoV-2) atveju. Camelyn citotoksiškumo tyrime buvo naudojama žiurkėnų jauniklių inkstų ląstelių linija 21 (BHK-21), hematopietinės kraujodaros kamieninės ląstelės (HSC), paimtos iš kaulų čiulpų ir blužnies ląstelės. Po išskyrimo procedūrų, ląstelių gyvybingumas buvo ivertintas tripano mčlynłljq dažq išskyrimu mikroskopu, naudojant hemocitometrą. In vitro ląsteliq augimo greitis buvo įvertintas, naudojant ląstelių skaičiavimo rinkinio 8 (CCK-8) testą. Ląstelės buvo pasėtos į auginimo terpę su ivairiomis Camelyn koncentracijomis (35 Hg, 50 big, 70 Hg, 100 Hg, 150 kłg ir 200 Hg). Absorbcija ties 450 nm nustatyta daugkartiniu skaitytuvu. Antivirusinis poveikis buvo įvertintas plokštelių mažinimo tyrimu, siekiant nustatyti SARS-CoV-2 jautrumą vaistams. Pasirinktų junginių skiedimas serijiniu būdu buvo iš anksto inkubuotas su 40—100 SARS-CoV-2 plokšteles formuojančiais vienetais (PFU). lš anksto inkubuotas Camelyn ir SARS-CoV-2 mišinys po to buvo idėtas i susiliejančias Vero E6 ląsteles, prieš tai inkubacinės ląsteles užfiksavus ir nudažius, o PFU skaičius buvo suskaičiuotas inversiniu mikroskopu ir nubrėžtas kaip antivirusinės koncentracijos logaritmo funkcija. Tyrimas parodė, kad Camelyn nėra citotoksinis, jis stimuliuojančiai veikia ląstelių proliferaciją ir turi slopinamąjį poveikį SARS-CoV-2 su EC50 (puse maksimalios efektyvios koncentracijos) nuo 85,7 gg/ml iki 192,4 gg/ml, priklausomai nuo produkto koncentracijos ir viruso plokštelių vienoje ląstelėje.

IVADAS
Dabartinė pandemija parodė, kad būtini įvairūs galimi COVID-19 gydymo ir prevencijos būdai, įskaitant esamus natūralius produktus. Ivairūs organiniai junginiai, įskaitant bičių medų, propolį, bičių pienelį, kurkuminą, resveratrolį, yra plačiai tiriami ir naudojami kaip galimi ivairių infekcijų gydymo būdai. Nepaisant šiuolaikinės medicinos kritikos pastaruoju metu, medus sulaukė didelio dėmesio dėl daugybės terapinių savybių, įskaitant antimikrobinį, priešuždegiminį ir antivirusinį poveikį [2,3]. Mokslininkai įvairius fitocheminius veiksnius, tokius kaip vandenilio peroksidas, lakiosios organinės rūgštys, lizocimas, gliukozės oksidazė, katalazė, pripažino turinčiais veiksmingą antibakterinį poveikį [4]. Bičių vaškas, žiedadulkės ir propolis yra svarbūs cheminiai junginiai, kurie medui suteikia antimikrobinių savybių [5, 6]. Meduje taip pat yra nedidelis oligosacharidų kiekis, susijęs su ivairių mikrobų, pavyzdžiui, žarnyno bakterijų, augimo słopinimu [7]. Fenolio junginiai, iskaitant flavonoidus, iš medaus, propolio ir bičių pienelio priskiriami biologiškai aktyvioms molekulėms, pasižyminčioms antimikrobiniu poveikiu [8, 9].
Šie fiziniai ir cheminiai veiksniai suteikia medui unikalių savybių. Nustatyta, kad medus šalina žaizdų infekcijas, mažina randų susidarymą, slopina uždegimą, stimuliuoja angiogenezę ir epitelio augimą [10]. Medaus priešuždegiminis _poveikis pasireiškė citokinų ekspresijos slopinimu [1 1]. Yra žinoma, kad medus gali pagerinti T ir B limfocitų dauginimąsi, stimuliuoja fagocitozę ir reguliuoja citokinų, tokių kaip naviko nekrozės faktorius (TNF), interleukinas I beta (IL-Ip) ir IL- 6, susidarymą iš monocitų [12]. Buvo nustatyta, kad medus ir keli jo komponentai blokuoja gaubtinės žarnos vėžio Iąsteliu ciklą GO/Gl fazėje [13, 14].
In vitro tyrimai parodé antivirusinį medaus poveikį skirtingų tipų virusams [15—17]. Antivirusinis medaus poveikis yra susijęs su įvairiais jo ingredientais, pavyzdžiui, variu, kuris yra medaus mikroelementas, inaktyvuojantis virusus. Fenolio junginiai, tokie kaip flavonoidai, askorbo rūgštis ar vandenilio peroksidas, skatina viruso augimo slopinimą, nutraukdami viruso transkripciją, transliaciją ir replikaciją [1], [18], [19]. Norėdami išsiaiškinti galimą medaus poveikį, plokštelių slopinimo tyrimai buvo naudojami Watanabe ir kt. tyrime [20]. Buvo nustatyta, kad Manuka medus veiksmingai slopino gripo viruso replikaciją (EC50 = 3,6 ± 1,2 mg/ml), kas rodo jo antivirusinį poveikį. Vieną kartą panaudojus 3,13 mg/ml Manuka medaus, zanamiviro arba oseltamiviro EC50 sumažėjo iki beveik 1/1 000. Rezultatai patvirtino, kad medus stipriai slopina gripo virusą, ir įrodė galimą jo medicininę vertę. lšanalizuotos skirtingos medaus iš aštuonių gėlių šaltinių rūšys, siekiant įvertinti ju anti-ŽIV-I poveikj ir poveikį limfocitu proliferacijai. Aštuonių skirtingų rūšių medaus anti-ŽIV-I poveikis buvo vertinamas atliekant kiekybini polimerazės grandininės reakcijos (YGR) tyrimą. Tyrimas atskleidė, kad monoflorinis (tos pačios augalų rūšies) medus turėjo anti-ŽIV-I poveikį, priklausomai nuo augalų ir metilgloksalio kiekio šių augalų biomasėje [21].
Abedi ir kt. tyrimas [22] pateikė keletą įrodymu apie galimą medaus ir jo junginių poveikį koronavirusui dėl ju savybės reguliuoti viruso prikibimą ir patekimą į priimančiąją Iąstelę bei RNR replikaciją. Medus ir jo komponentai taip pat gali reguliuoti Iąstelių signalizacijos kelius, įskaitant oksidacinį stresą, uždegimą ir apoptozą.
Vienas antivirusinio poveikio mechanizmas yra virusų baltymų, igalinančių prikibti ir patekti į priimančiasias Iąsteles, slopinimas [23]. Buvo pažymėta, kad medus gali paveikti disulfidinius ryšius hemagliutinino baltymo HA receptoriuose, o tai apsaugo nuo gripo viruso prikibimo prie priimančiosios Iąstelės paviršiaus. Koronaviruso spygliuotasis baltymas priklauso tai pačiai baltymų šeimos klasei [24]. Buvo pranešta, kad [25,26] medaus junginiai, tokie kaip kvercetinas, chrizinas, kaempferolis, galanginas ir kofeino rūgštis, pasižymi antivirusiniu poveikiu CO VID19 dėl stipraus prikibimo prie pagrindinės proteazės ir viruso replikacijos. Pagrindiniai medaus junginiai, tokie kaip kaempferolis, galanginas ir kofeino rūgštis, gali slopinti viruso adsorbciją, invaziją ir dauginimąsi. Chrysinas gali užkirsti kelią viruso patekimui į priimančiąsias Iąsteles ir viruso replikacijai. Guercerinas gali slopinti viruso dangą, invaziją ir replikaciją [27-29]. Naujausi tyrimai ir straipsnis, pateikiantis galimo medaus farmakologinio poveikio apžvalgą [30] rodo, kad medus ir jo pagrindiniai komponentai gali turėti įtakos koronavirusinės infekcijos, įskaitant COVID-19, prevencijai ir gydymui.
Nors antimikrobinis medaus poveikis daugeliui bakteriju ir grybelių [31] [32] buvo gerai ištirtas, jo antivirusiniam poveikiui įrodyti vis dar reikia išsamiu tyrimą, kad jis galėtu būti naudojamas ivairią virusinių infekcijų prevencijai ir gydymui. Šiuo tyrimu buvo siekiama įvertinti antivirusinį medaus ekstrakto Camelyn poveikį sunkaus ūminio respiracinio sindromo koronaviruso 2 (SARS-C0V-2) atveju.

MEDŽIAGOS IR METODAI
Komercinio produkto „Camelyn” ampulės, tiekiamos UAB „Silicon Biotechnology”, yra pagamintos iš pasirinkto medaus ekstrakto. Ampulės turinį sudaro 35% Camelyn ir 65% injekcinio vandens. Camelyn sudėtyje yra ketonų, eterių, bioorganinių rūgščių, fenolių, aldehidų ir furfurolo. Citotoksiškumui ir antivirusiniams tyrimams atlikti Camelyn buvo atskiestas iki galutinės koncentracijos nuo 10 gg/ml iki 2500 gg/ml.
Eksperimentiniai gyvūnai
Sešių savaičių amžiaus BALB/c pelės (n = 3) buvo veisiamos ir laikomos veisimo įstaigoje Valstybiniame tyrimų institute Inovatyvios medicinos centre (Lietuva). Visos procedūros buvo vykdomos vadovaujantis Europos Sąjungos institucinėmis gairėmis, ir jas patvirtino Lietuvos bandomųjų gyvūnų naudojimo etikos komisija prie Valstybinčs maisto ir veterinarijos tarnybos Nr. G2-124 (2019.07.11). Gyvūnai buvo laikomi kontroliuojamos temperatūros aplinkoje (23±1 0C). Maistas ir vanduo buvo teikiami ad libitum.
Ląstelių paruošimas
Žiurkėnų jauniklių inkstų ląstelių linija 21 (BHK21) buvo gauta iš Vilniaus universiteto Gyvybės mokslų centro (Lietuva). Tėvų BHK-21 ląstelės buvo pasėtos į didelio gliukozės koncentracijos Dulbecco modifikuotą „Eagle” terpę (DMEM) (4,5 g/l) („Life Technologies”, JAV), papildytą 10% FBS (Lonza, Šveicarija) ir 1% antibiotikais (penicilinu ir 10 000 U streptomicinu) (Lonza, Šveicarija). Kultūros buvo laikomos 3 TC ir 5% C02 atmosferoje. Ląstelių monosluoksnis buvo išsklaidytas naudojant 0,25% tripsino ir EDTA (Lonza, Šveicarija) mišinį.

Kraujodaros kamieninės ląstelės (HSC), gautos iš kaulų čiulpų, buvo išskirtos, išplaunant BALB/c pelių šlaunikaulį ir blauzdikaulius, kaip anksčiau aprašyta Juppperi ir kt. tyrime [33] su tam tikromis modifikacijomis. Blužnies ląstelės buvo išskiriamos švelniai spaudžiant-disocijuojant audinius, naudojant PBS, ir tada praleidžiamos per 70 gm sterilų ląstelių koštuvą. Surinktos HSC ir blužnies ląstelių suspensijos buvo plaunamos su PBS ir tada frakcionuojamos tankio gradiente,naudojant limfolito M (Cedarlane, JAV) terpę pagal gamintojo rekomendacijas. Izoliuotos HSC ir blužnies ląstelės buvo tris kartus plaunamos „Roswell Park Memorial” instituto RPMI-1640 terpėje su 10% FBS (Lonza, Šveicarija) ir 1% antibiotiku (penicilinu ir 10 000 V streptomicinu (Lonza, Šveicarija), centrifuguotos 10 min. 300 x g, pakartotinai suspenduotos ir suskaičiuotos. Po išskyrimo procedūrų ląstelių gyvybingumas buvo įvertintas tripano mėlynojo dažiklio (0,4%, m/V) išskyrimu su „Nikon ECLIPSE 50i” („Nikon”, Japonija) mikroskopu, naudojant hemocitometrą.
Camelyn citotoksiškumo tyrimas
In vitro ląstelių augimo greitis buvo įvertintas, naudojant ląstelių skaičiavimo rinkinį Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Laboratories, Japonija) pagal gamintojo rekomendaciją, Dvi x 105 BHK-21, HSC ir 5 x 105 blužnies ląstelės buvo pasėtos auginimo terpėje į 96 duobučių plokšteles ir 72 valandas inkubuotos su Camelyn kontroline ir kitomis koncentracijomis (35 ktg, 50 pg, 70 gg, 100 gg, 150 kłg ir 200 gg) 37 0C temperatūroje 5% C02 atmosferoje. Absorbcija ties 450 nm nustatyta daugkartiniu skaitytuvu Sunrise (Tecan, Austrija). Camelyn gydytų ląstelių gyvybingumas buvo lyginamas su kontrolinėmis ląstelėmis (neapdorotomis) ir apdorotomis DMSO (teigiama kontrolė). Visi tyrimai buvo atlikti trimis nepriklausomais eksperimentais.
SARS-CoV-2 plokštelių mažinimo tyrimas
Junginys buvo ivertintas plokštelių mažinimo tyrimu, siekiant nustatyti jautrumą vaistams SARS-CoV-2/Kvebek0 miestas/21697/2020. Pasirinkti junginiai buvo ivertinti atliekant plokšteliu mažinimo tyrimą – aukso standarto fenotipini metodą, skirtą nustatyti SARS-CoV-2 jautrumą vaistams. Trumpai tariant, susiliejančios Vero E6 ląstelės buvo pasėtos po I x 105 ląstelių/duobutėje į 6 duobučių plokšteles. Pasirinkti junginiai, atskiesti serijiniu būdu, buvo iš anksto inkubuoti su 40—100 SARS-CoV-2 plokšteles formuojančiais vienetais (PFU) 60 minučių 37 0 C temperatūroje 5% C02 atmosferoje. Iš anksto inkubuotas junginio ir SARS-CoV-2 mišinys buvo idėtas prie susiliejančių Vero E6 ląstelių ir inkubuotas 60 minučių 37 0C temperatūroje 5% C02 atmosferoje. Po to inokulatas buvo pašalintas ir užkrėstos ląstelės buvo inkubuojamos tris dienas (be junginio) minimalioje pagrindinėje terpėje (MEM) (Merck, Vokietija) su 2% galvijų vaisiaus serumu (Thermo Fisher Scientific, JAV), kuriame buvo 0,6% SeaPlaque agarozės (Lonza, Šveicarija). Ląstelės buvo užfiksuotos ir nudažytos, o PFU skaičius buvo suskaičiuotas inversiniu mikroskopu ir nubrėžtas kaip antivirusinės koncentracijos logaritmo funkcija. Tada buvo apskaičiuotos EC50 vertės. Lygiagrečiai, plokšteliu mažinimo tyrimu buvo ivertinti antivirusiniai vaistai favipiraviras ir remdesiviras pagal standartini protokolą (be išankstinio viruso inkubavimo su vaistais), siekiant nustatyti SARS-CoV-2 jautrumą vaistams.
Statistinė analizė
Statistinė analizė buvo atlikta naudojant „Microsoft Excel” ir „IBM SPSS Statistics”
REZULTATAI
Citotoksiškumo tyrimas
Citotoksiškumo tyrimas yra kiekybinis skirtumo tarp Iąstelių žūties ir Iąstelių augimo nustatymas. Jis buvo naudojamas mūsų eksperimentuose, siekiant įvertinti galima medaus produkto poveikį Iąsteliu augimui ir dauginimuisi. Kiekvienoje Camelyn medaus ekstrakto ampulėje buvo 2 ml gintaro spalvos injekcinio tirpalo. Veikliųjų junginių kiekis buvo 0,035 g/ml. Nė viena iš ištirtų Camelyn koncentracijų (35 Hg, 50 Hg, 70 Hg, 100 big, 150 pg ir 200 Hg) nepasižimėjo neigiamu citotoksiniu poveikiu (la, lb, Ic paveikslai). Didesnė Camelyn koncentracija žymiai padidino kraujodaros kamieninių Iąstelių.

programinės įrangos paketą 25. Santykiams tarp kintamųjų buvo naudojamos „Spearman” rango koreliacijos. Statistiškai reikšmingu buvo laikomas p-vertés <0,05 tikimybės lygis. kiekį. Palyginti su kontroline koncentracija, HSC skaičius svyravo nuo 1 14%, Camelyn koncentracijai esant 70 pg/ml, ir iki 206%, koncentracijai pasiekus 200 pg/ml. tendencijos buvo pastėbėtos ir Iąstelių linijos BKH-21 tyrime (l a, lb pav.). Ląstelių skaičius padidėjo nuo 1 16% iki 203%, koncentracijai padidėjus nuo 70 pg/ml iki 200 gg/ml. Stimuliuojantis Camelyn poveikis buvo dar ryškesnis blužnies Iąsteliu augimui. Pradedant nuo Camelyn koncentracijos 50 gg/ml, blužnies Iąstelių augimas didėjo, o eksperimento pabaigoje vidutinis apdorotu ląstelių skaičius buvo daugiau nei 3 kartus didesnis, lyginant su kontroline koncentracija. SARS-CoV-2 plokštelių mažinimo tyrimas Norint ivertinti medaus produkto „Camelyn" antivirusinį poveikį SARS-CoV-2, nustatyta pusiau maksimali veiksminga koncentracija (EC50). Susiliejančios Vero E6 Iąstelės buvo pasėtos į 6 duobučių plokšteles. Camelyn, du kartus praskiestas serijiniu būdu, 60 minučiu buvo inkubuotas su maždaug 50—100 plokštelę formuojančiu vienetu (PFU) SARS-CoV2/Quebec City/21697/2020 ir panaudotas Iąstelėms užkrėsti. Po 3 dienu inkubacijos (be Camelyn) Iąstelės buvo užfiksuotos ir nudažytos violetiniu kristalu. PFU skaičius buvo suskaičiuotas inversiniu mikroskopu ir nubrėžtas kaip antivirusinės koncentracijos logaritmo funkcija, siekiant gauti EC50. Ląsteles užkrėstus 100 PFU, medaus ekstrakto Camelyn koncentracija nuo 9,08 gg/ml iki 72,6 gg/ml turėjo nereikšmingą poveikį viruso plokštelių sumažėjimui. Viruso plokšteliu skaičius sumažėjo 4,5-13,5%. Didesnė 145,3 gg/ml koncentracija sumažino viruso plokšteliu skaičiu iki 53,85% (2 pav.). EC50 siekė 192,4 gg/ml. Viruso pasėlį sumažinus iki 25-30 PFU, Camelyn koncentracijos nuo 9,08 gg/ml iki 36,3 gg/ml dėka viruso plokšteliu skaičius sumažėjo 30-33% (2 pav.). Pradedant nuo 72,6 gg/ml 120 100 20 200 koncentracijos, viruso plokšteliu skaičius Ženkliai sumažėjo, lyginant su kontrole koncentracija. Šis tyrimas atskleidė, kad medaus ekstrakto koncentracija Camelyn pasižymėjo slopinamuoju poveikiu, EC50 esant 85,7 gg/ml. Siekiant patikrinti slopinimo poveikį, buvo atliktas papildomas bandymas naudojant koncentrato produktą - Camelyn tabletes. Camelyn tablečiu slopinimas pasižymėjo panašiu poveikiu viruso plokštelių skaičiui. Tačiau koncentruoto Camelyn tabletės tirpalo prąskiedimai pasižymėjo stipresniu slopinančiu poveikiu, EC50 esant 1 16,27 73,39 gg/ml, o ulkréstumui siekiant 100 PFU. Mūsų rezultatai parodė, kad Camelyn ekstraktas, galimai turi slopinamoji poveiki SARS-CoV-2 replikacinio ciklo pradiioje. Palyginimui, nustatyta, kad antivirusinis favipiraviro ir remdesiviro vaistu poveikis EC50 buvo atitinkamai 15,71 gg/ml (100 HM) ir 0,616 gg/ml (1,16 HM). Wang ir kt. [34] nustatė, kad favipiraviras in vitro turi poveiki SARS-CoV-2, nors ir reikalinga jo didelę koncentraciją, palyginti su remdesiviru (EC50 61,80 HM). Pažymėtina, kad remdesiviras stipriai blokavo viruso infekciją esant maiai mikromolinei koncentracijai (EC50 - 0,77 VIM) [35]. AUTORIŲ INDĖLIAI Konceptualizacija, L.K . ; metodologija, M. B., L. K. ir G. B.; formali analizė, I.G . ; tyrimas, M. B. ir A. L.; rašymas - originalo projekto parengimas, L.K .; ragymas - peržiūra ir redagavimas, M.B, A.L., N.J . ; vizualizacija, I.G .; priežiūra, R.B finansavimo gavimas, P. J. Visi autoriai perskaitė ir sutiko su paskelbta rankraščio versija. PADĖKOS Medžiagos, naudojamos eksperimentams, kurias teikia UAB „Silicon Biotechnology". Šį tyrimą finansavo Lietuvos Respublikos mokslo, inovaciju ir technologiju agentūra (MITA) (stipendijos Nr. 01.2. I -MITA-T-851-02-0248 PJ) ir Kanados sveikatos tyrimo institutas (stipendija) Nr. 170629 MB). INTERESŲ KONFLIKTAI Tarp autoriu nėra interesu konflikto.